相关链接：韩春雨：「一鸣惊人」的中国科学家发明世界一流新技术 韩春雨团队发现的 NgAgo 基因编辑技术有可能在将来取代 CRISPR 被广泛运用吗？ 知乎用户，合成生物学 （知乎日报注：本文内含专业词汇非常多，无法一一注解，抱歉给非生物专业读者带来了不好的阅读体验。更浅显的解读可以戳底部「查看知乎讨论」获得，此处展示专业的回答，请尊重答主的专业性和劳动成果。） 这项研究本身是有价值的，当然是不是像有些人说的目前就到了打脸 CRISPR 的程度，我觉得言之尚早。 目前来看这个研究的价值还要观望。我想大部分关注 CRISPR 的朋友应该都还对 2014 年那篇 DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute 有一些印象，其实当时很多人的态度也是再观望一下，我记得当初实验室里做 CRISPR 的 review 报告的时候还提了一下说现在发现 DNA 也可以介导定点内切了。现在经过两年观望，我们观望出了这样一项成果，可以说很欣喜的是它在往好的方向发展，希望能够保持这种势头。 一项 DNA 编辑技术是否有优势涉及到方方面面。从目前的情况来看，NgAgo 的优势很明显，主要体现在 1）反应效率不低（不说高，但不低） 2）特异性较好 3）不依赖 PAM 4）NgAgo 本身不大 这都是优势，但是仅仅这些方面并不够，还需要研究更多问题，比如特异性好是有限实验基础上的理论结论，实际应用脱靶率如何要看具体情况。 目前来看有几项事关这项技术未来的、待验证的问题是： 1）系统正交性 2）多位点编辑能力 3）NgAgo 蛋白的模块化程度 4）ssDNA 的通用性 不要小看上述问题，条条都是卡脖子的，一条不给力就会被 CRISPR 比下去。 比如和各种生物细胞内生物系统的正交性如何？目前知道 TtAgo 在真核到原核细胞中广泛存在同源基因，这个在文章中是作为某种优势来讲的，但实际上可能是一个劣势。因为正交性问题就不得不考虑，在人类细胞中好用未必在所有细胞中好用。大家可能注意到了，文章开篇第二个实验就是做了一个简单的正交性测试，测试结果还不错，文中提到 which implies that there is very limited 5 ′ phosphor-ylated ssDNA present in human cells, suggesting that endogenous ssDNAs will not mislead NgAgo to off-target sites 这当然不足以说明 NgAgo 在各种细胞平台都具有高正交性，作者也用了 implies 的措辞，还有待进一步证实。 除此之外，多位点编辑能力是 CRISPR 的一项重大优势。我们现在知道 NgAgo 和 ssDNA 的结合是非常稳定的，这当然是某种优势，但也可以是劣势。文中提到： similar to mammalian Ago2, which cannot exchange its bound oligos with free oligos at 37 °C 这样的性质是否会影响到 NgAgo 的多位点编辑潜力不得而知。我看到大部分评论都没有提到这个问题。 CRISPR 还有一个亮点是 Cas9 的模块化结构，可以容许进行较多的蛋白工程改造，NgAgo 是否有这样的高度模块化的性质也将直接决定这项技术能否问鼎优秀 DNA 编辑技术的地位。另外还有 ssDNA 在各种细胞平台中如何使用等等问题，我们现在知道 CRISPR 系统一般通过 sgRNA transcription vector 来做介导核酸，DNA 显然不能用这招，这就限制了 NgAgo 在一大类物种当中的应用潜力。这些都需要进一步研究。 我觉得韩春雨老师有一个想法是对的，就是一旦发表，有兴趣的实验室会很快跟进去做这些工作。美国一些合成生物学实验室资源极优，不是他们可以竞争得过的，无论这个低温 NgAgo 蛋白潜力如何，很快就会有结论。不必着急，是金子总会发光。 P.S. 这个成果目前为止最大的意义恐怕是它是在研究条件相当一般的实验室中实现的，这是很值得重视的一件事。再次拷问了我国的科研经费分配体系。有的大几百万的项目就为了给某个海鲜搞个全基因组图谱搞个文库什么的，而国内还有一些合成生物学研究却无法摆脱传统基因工程的影子，用合成生物学的瓶子装基因工程的酒，这是非常遗憾的。 阅读原文 韩春雨团队在《Nature Biotech》上发表的 NgAgo 基因编辑技术是什么？有何突破？ 张浩千，合成生物学家 对于生物学技术，要针对科研和应用需求，深入了解细节再进行判断，不能人云亦云。同意 @yang Liu 的谨慎态度，部分同意 @孟浩巍 的乐观分析。 NgAgo 的缺点其实是很明显的：只能切割 ssDNA 和具有负超螺旋构象的 DNA（SC DNA，比如质粒），对于线性化双链 DNA 是没有切割活性的。这说明：一，NgAgo 无法用于 dsDNA 在体外温和环境下的编辑处理，因此很难用于开发相关的体外分子生物学工具，这比起 Cas9 是一大劣势；二，在分裂生长不迅速的细胞中，基因组上 ssDNA 的暴露有限，基因组 DNA 的 SC DNA 比例不高，因此 NgAgo 很有可能也无法进行有效编辑。此外，在生物医疗应用中，向人类细胞中导入外源 DNA 是很忌讳的，CRISPR-Cas9-sgRNA complex 导入人体细胞后不会在细胞中长期存在，而 NgAgo 的 gDNA 导入细胞后可能会被整合到基因组上，进而带来 ethic issue，这一点也是不能忽略的。 至于为什么 NgAgo 只能切割 ssDNA 和 SC DNA，原因很可能正是 NgAgo 没有 PAM 序列依赖性。从前些时候发表的 CRISPR-Cas9 的单分子观测可以知道，PAM 对于 Cas9 的作用可不单是位点识别，更重要的是 gRNA 与 DNA 的结合起始处；也就是说，PAM 处先打开一小段，让 gRNA 的 seed sequence 做 strand invasion，然后整条 gRNA 才能达成对于 target sequence 中 DNA 双链的打开和替换，整个过程相当于通过 PAM 实现了一个动力学上进行快速 target binding 的路径；换言之，PAM 的依赖性是 Cas9 在 editing feasibility 和 target binding kinetics 之间进行妥协平衡的结果。NgAgo 没有 PAM 依赖性，而文章 Supplementary Fig. 3 也表明 NgAgo 确实无法切割线性化的 DNA，但对于双螺旋结构不稳定的 SC DNA 和没有双螺旋结构的 ssDNA，NgAgo 却具有正常切割活性，这些结果强烈地暗示，没有 PAM 的代价就是 NgAgo 无法单靠自己的力量打开正常 dsDNA 的双链结构。 我们再看看能够切割 DNA 的 bacterial argonaute 的来源，都是极端嗜热古生菌和极端嗜盐古生菌。嗜热古生菌的生存温度通常在 60 摄氏度以上，这种温度下 DNA 双链结构本身就不稳定（类似于我们做 PCR 的环境）。NgAgo 来源于极端嗜盐古生菌，我将其蛋白质序列用于 NCBI non-redundant protein database 的检索，得到 BLAST 结果的前十都是极端嗜盐古生菌，其基因组的 GC 含量均在 60%以上。以前的生化知识告诉我们，当 DNA 的 GC 含量较高，且位于高盐浓度环境中时，DNA 的负超螺旋比例会显著提高；因此这些基因组 GC 含量高的极端嗜盐古生菌的基因组 DNA 很可能存在着大比例的负超螺旋。这就解释了为什么 DNA-editing bacterial argonaute 的来源不是极端嗜热古生菌就是嗜盐古生菌——只有在这两种菌的生存条件下，bacterial argonaute 才能有效执行 DNA editing 的功能。 我们回过头来看 NgAgo 的优点，有三点。第一，NgAgo 和 gDNA 转染哺乳动物细胞的实验方法，特别是在 multiplexed editing 方面，应该会比 CRISPR-Cas9 简化很多，毕竟 gDNA 只需要合成拿到手里就可以转染，不必再像 CRISPR-Cas9 一样需要特殊的载体或者牺牲转染效率. 第二，NgAgo 毕竟摆脱了 PAM 的限制，对于一些 DNA 特殊序列的 editing 应该会特别有用，比如 AT-rich 的基因组复制起始位点。第三，前人的实验表明 CRISPR-Cas9 在哺乳动物细胞中很容易被内源 RNA 干扰，而 NgAgo 由于只能结合 ssDNA，所以内源 RNA 的干扰是可以忽略的，这也暗示了 NgAgo 对于负超螺旋程度不高的细胞基因组 DNA 切割能力应该不如 Cas9 但体现出来的效率却与后者相差无几的原因。 总体来说这是一个创新性极强，应用前景尚且不明朗的工作；NgAgo 的优劣势在行内人看来是很明显的，如何根据具体的生物工程和科研场景来使用好这个新的合成生物学工具，是未来生物科研界的一个值得追踪的有趣问题。 最后结尾多说两句。NgAgo 作为合成生物学的新工具，其发掘过程所依赖的 bioinformatics 技术并没有什么特别之处，仅仅是生物科研日常使用的 NCBI 数据库；但其所依赖的思路非常可贵。TtAgo 可以切割 DNA，但必须需要高温→寻找带有 TtAgo homolog 但生存温度温和的细菌→挖掘出 NgAgo，这一思路正印证了可能是 20 世纪最伟大的生物进化与遗传学家 Theodosius Dobzhansky 曾说过的话，"Nothing in Biology Makes Sense Except in the Light of Evolution"。在我看来，生物实验室里大多数搬砖的人以及监督别人搬砖的人，早已沉溺在搬砖的细节而忘记了这句话的含义。 我的导师欧阳颀院士曾说，需要复杂统计方法才能得到的相关性就不是相关性。这句话对应到合成生物学的元件发掘过程就可以表述为，合成生物学的元件发掘不需要太高深的生物信息学，关键还是指导发掘的思想。每次看到国内外有人用自己的生物信息算法多高深多复杂来证明自己的元件好，合成生物学做得好，我的内心都是平静的。 真心希望越来越多工作在北清浙复交之外高校的年轻老师们做出这样创新性极强的工作。我们的高校科学资金目前还绝大部分集中在北清浙复交这几所学校里；韩春雨能在艰难的科研环境和窘迫的资金支持下做出这样的工作，实为难能可贵。这也提醒科技部领导们，科研资源不能仅仅集中在北清浙复交这几所学校，我们这个国家里，有科研追求的年轻一辈，还多得很呐。 阅读原文
